As enzimas de restrição funcionam como uma espécie de “tesoura molecular”: elas identificam sequências de pares de bases nitrogenadas específicas nas moléculas de DNA e cortam-nas nessas regiões. Cada tipo de endonuclease de restrição identifica e corta somente uma dada série de nucleotídeos, geralmente composta por 4 ou 6 pares de bases. O local onde a molécula de DNA é clivada pela enzima recebe o nome de sítio de restrição.
É muito provável que as enzimas de restrição tenham sido desenvolvidas pelas bactérias ao longo do seu processo evolutivo, com uma forma de proteção contra ataques de bacteriófagos. Assim, quando uma molécula de DNA do vírus é introduzida na bactéria, rapidamente é clivada nos sítios de restrição, deixando de funcionar. Isso não acontece com as moléculas de DNA da própria bactéria, pois existem enzimas protetoras que evitam a ação das endonucleases de restrição no genoma bacteriano.
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